ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AMOXICILINA EM PLASMA HUMANO POR LC/MS/MS
AUTORES: RAPOSO C.M.A. - FIOCRUZ; DAMACENO M.M. - FIOCRUZ; OLIVEIRA C.F. - FIOCRUZ; FERREIRA-FILHO M. - FIOCRUZ; SIPOLI M.A.M. - UFRJ/FIOCRUZ E WERNECK-BARROSO E. - FIOCRUZ
RESUMO: Um método para quantificação de amoxicilina (AMX) foi desenvolvido utilizando-se LC/MS/MS. A extração foi realizada por precipitação com acetonitrila acidificada com 10mM de ácido fórmico e 10µL do extrato final foram injetados. Uma boa separação cromatográfica foi obtida utilizando-se uma coluna C18 e uma fase móvel de água-acetonitrila (85/15) em condições isocráticas com fluxo foi de 0,3mL/mim. A determinação foi em ionização por eletrospray. As transições monitoradas foram 366.0>114.1 e 368.0>174.2 para AMX e CFC, respectivamente. O método foi validado respeitando as exigências da ANVISA. A curva de calibração foi linear numa faixa limite de 0,02 – 20,00µg/mL. A recuperação absoluta foi de 81,83% (AMX) e 79,85% (CFC). O método desenvolvido foi aplicado na análise de amostras clínicas.
PALAVRAS CHAVES: amoxicilina, lc/ms/ms, β-lactâmicos
INTRODUÇÃO: A amoxicilina, descoberta em 1972, é uma das substâncias que fazem parte do grupo de antibióticos que possuem o grupamento químico β-lactâmico, sendo um dos mais utilizados no Brasil. O Cefaclor, composto escolhido como padrão interno, também faz parte deste grupo (figura 1). Poucos métodos para determinação e quantificação de AMX são encontrados na literatura. Processos muitos demorados são observados, indo desde longos tempos de corrida (chegando em 38,8min - PETER et al.,1996), até tempos de preparo muito lentos (HERMANN et al.,1998). O mais baixo limite de quantificação (CQ-LIQ) encontrado foi de 0,05 µg/ml (PETER et al,1996), sendo insuficiente para o presente estudo que teve 500mg de dose administrada exigindo assim um (CQ-LIQ) de 0,02µg/ml. Apenas um método encontrado foi realizado em LC/MS/MS, com ionização por electrospray em modo negativo (KYUNG-HWAN et al.,2004). O método foi avaliado segundo a linearidade, especificidade, precisão, exatidão e diferentes condições e tempos de exposição. Um sensível e específico método foi proposto para a determinação de amoxicilina em plasma humano utilizando-se cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.
MATERIAL E MÉTODOS: Os padrões analíticos, AMX e CFC, foram doados por Far-Manquinhos. As soluções de trabalho (STB) da AMX foram preparadas por diluições sucessivas da solução mestre (SME – 1mg/ml) com Água Milli-Q gerando concentrações de 0,08 – 80,00µg/ml. A STB do padrão interno (PI) foi preparada por diluição da SME (1mg/ml) gerando uma STB de concentração 10,00µg/ml. A extração foi realizada por precipitação protéica, pipetando 200µl de plasma onde foram adicionados 50µl de PI e 50µl das STB de AMX; 400µl de acetonitrila, acidificada com 10mM de ácido fórmico, foi adicionada. A mistura foi agitada por 30s e centrifugada a 19975g por 5 min; 100µl do sobrenadante foi diluído com 400µl de Água Milli-Q (10mM de ácido fórmico). Agitou-se por 10s e transferiu-se 200µl do extrato para um vial onde 10µl foram injetados. Uma boa separação cromatográfica foi obtida utilizando-se uma coluna C18 e uma fase móvel de água/acetonitrila/ácido fórmico (85:15:10mM) em condições isocráticas com fluxo foi de 0,3mL/mim. A análise foi realizada em um LC/MS/MS modelo API 4000 em modo de ionização eletrospray positivo. As seguintes transições foram utilizadas: m/z 336.0>114.1 para AMX e m/z 368.0>174.0 para o CFC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: O método foi validado obedecendo aos requisitos estipulados pela Resolução – RE N.º899 da ANVISA. O método desenvolvido apresentou-se robusto, rápido, altamente sensível e seletivo. As curvas de calibração foram compostas por dez níveis, sendo 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000, 8000, 16000 e 20000 ng/ml e apresentaram coeficientes de correlação maiores que 0,9928 (Fig.2a). A recuperação absoluta da AMX foi de 81,83% (C.V. ± 2,72) e a recuperação relativa foi 101,69% (C.V. ± 5,21). A recuperação absoluta do PI foi de 80,30 (C.V. ± 5,20). A exatidão inter-dia e os testes de estabilidade para os controles de qualidade estão apresentados na tabela 1 a 4. Um CQ-LIQ de 0,02µg/ml foi alcançado e para essa concentração obtivemos um sinal-ruído de 25,2 (Fig.2b), indicando que com o método desenvolvido, poderíamos chegar a um CQ-LIQ ainda mais baixo, já que para a legislação atual um sinal-ruído de 5 é aceitável. O presente método apresentou rápido processo de preparação das amostras, modo de ionização por eletrospray positivo e curto tempo de corrida, diferindo daqueles encontrados na literatura (HERMANN et al., 1998, KYUNG-HWAN et al., 2004 e PETER et al., 1996, respectivamente).
CONCLUSÕES: O método desenvolvido apresentou-se linear, exato e robusto. A rapidez de preparo e análise das amostras garantiu que não houvesse degradação do fármaco, como pode ser observado através dos resultados obtidos nos testes de estabilidade. A faixa de linearidade da curva de calibração permitiu a determinação do CMÁX e TMÁX do fármaco de maneira confiável. O baixo tempo de corrida encontrado também permitiu a análise de aproximadamente 300 amostras por dia.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:HERMANN, J. M.; CHRISTIAN K. 1998. Determination of amoxicillin in human serum and plasma by high-performance liquid chromatography and on-line postcolumn derivatisation. Journal of Chromatography A, 812: 221–226.
KYUNG-HWAN, Y.; SO-YOUNG, L.; WON, K.; JONG-SEI, P.; HIE-JOON, K. 2004. Simultaneous determination of amoxicillin and clavulanic acid in human plasma by HPLC–ESI mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 813: 121–127.
PETER, M.; RAINER, M.; HANNELORE, B.; WOLFGANF, W; BOLTEN; HARTMUT, V. 1996. Improved high-performance liquid chromatographic determination of amoxicillin in human plasma by means of column switching. Journal of Chromatography A, 729: 259-266.