46º CBQ - DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO SIMPLES E RÁPIDO PARA DETERMINAÇÃO DE METFORMINA NO PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CLAE-EM): APLICAÇÃO A ESTUDOS DE FARMACOCINÉTICA.

ÁREA: Química Analítica

TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO SIMPLES E RÁPIDO PARA DETERMINAÇÃO DE METFORMINA NO PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CLAE-EM): APLICAÇÃO A ESTUDOS DE FARMACOCINÉTICA.

AUTORES: SOARES A.S. – FIOCRUZ, UFRJ; MARQUES M. A. S. – FIOCRUZ, DQA/UFRJ; BARROSO P.T.W. - FIOCRUZ, UFRJ; FILHO M. F. - FIOCRUZ E BARROSO E. W. - FIOCRUZ
(ALCENIRSOARES@YAHOO.COM.BR)

RESUMO: Foi desenvolvido e validado um método para a extração e a quantificação de metformina (MET) no plasma por CLAE-EM. A preparação da amostra consistiu na precipitação de proteínas. Metoprolol (MTP) foi usado como padrão interno. A detecção e a quantificação foram efetuadas por EM in tanden. As transições foram 130.1 → 71.0 e 268.2 → 116.0 para a MET e MTP, respectivamente. O tempo de corrida foi de 3 min., com tempo de retenção de 1,0 e 1,2 min. para MET e MTP, respectivamente. As curvas de calibração foram lineares, com coeficiente de determinação de 0,997 (CV = 0,24 %, n=10). A exatidão e precisão dos testes de estabilidade, ensaios inter dia e recuperação, apresentaram valores de acordo com os exigidos para estes métodos bioanalíticos (GUINDANCE FOR INDUSTRY, 1998).

PALAVRAS CHAVES: metformina; clae-em; farmacocinética.

INTRODUÇÃO: Existem vários métodos para a quantificação de metformina em amostras biológicas na literatura (AHMADIANI et. al, 2005; ZHANG et. al, 2001). Entretanto, a maioria deles possui procedimentos de preparação da amostra complexos. O advento de técnicas de detecção mais específicas e sensíveis tem possibilitado o uso de procedimentos mais simples de extração e purificação como a precipitação de proteínas do plasma e a extração líquido-líquido (ELL). Apesar da extração por fase sólida (EFS) propiciar um extrato mais puro, o seu sucesso depende do tipo de fase, da escolha do solvente e das condições do pH. Sendo assim, alternativas seriam: ELL e a precipitação de proteínas do plasma. Porém a ELL, envolve diversas etapas, incluindo a evaporação que consome muito tempo na preparação da amostra. Conseqüentemente, a finalidade deste estudo é desenvolver um método rápido, simples e eficaz, de acordo com os parâmetros e critérios da aceitação adotados para métodos bioanáliticos (GUINDANCE FOR INDUSTRY, 1998), para a extração do metformina do plasma humano usando precipitação de proteínas e detecção por CLAE-EM.

MATERIAL E MÉTODOS: O padrão de MET foi adquirido da USP. MTP foi doado pelo INCQS/RJ. Todos os solventes foram obtidos da Tedia INC. As soluções estoques de padrões foram preparadas na concentração de 1mg/mL em metanol-água (50/50, v/v) e diluídas para o preparo das soluções de uso. Um pool de amostras de branco do plasma de voluntários saudáveis foi usado para a validação do método. Método: foram adicionados à 200µL de branco de plasma 50µL de solução de MET (concentração apropriada) e 50µL de MTP (100 ng/mL). A mistura foi homogeneizada em vórtex por 10 s. 40µL de NaOH e 600µL de acetonitrila foram adicionados ao tubo e este agitado por 1 min. e, em seguida centrifugado (14000 rpm, 5 min). A fase líquida foi transferida para outro tubo contendo 100 µL de metanol-água (50/50, v:v) e 120µL de HCl 0,1M e a mistura homogeneizada por 30s em vórtex. Ao extrato final foi adicionado 10µL de NH4OH 1M. 20µL do extrato foram injetados no CLAE-EM da Varian®. Amostras de plasma de 26 voluntários com idade: 28,5  3,5 anos, massa corporal: 63,5  3,5 Kg e altura de 1,63 3,0 cm administrados com 800 mg de MET foram analisadas a fim de avaliar a farmacocinética.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: A análise por CLAE de substâncias hidrofílicas, tais como a MET, no plasma visando estudos farmacocinéticos requerem um método rápido, sensível e robusto, devido ao limite de quantificação e ao elevado número de amostras processadas. Conseqüentemente as condições de CLAE têm que ser otimizadas. As condições de extração, de análise (pH alto do extrato) e eletrospray possibilitaram a obtenção de um extrato límpido e análise cromatográfica rápida e sem supressão iônica, ao contrário do observado na literatura, onde a técnica de ionização química a pressão atmosférica (APCI) teve que ser usada para atingir tais objetivos, com procedimento de extração mais complexo envolvendo precipitação seguida de lavagem do extrato com diclorometano (GU J. et al., 2004). Os ótimos valores da exatidão e precisão dos testes de estabilidade, ensaios inter dia e recuperação apresentados pelo presente método (tabela 1, 2 e 3) e a linearidade (20-5000 ng/mL) são devido tanto ao procedimento de extração adotado quanto as mudanças de pH durante a etapa de extração que propiciaram uma significativa separação do analito dos interferentes da amostra (fig. 1), reduzindo efeito de matriz.

CONCLUSÕES: Os resultados obtidos comprovam que o procedimento adotado para a extração e purificação do analito a partir de plasma humano é simples, rápido, evitando a degradação da droga, permitindo a preparação e análise de 500 amostras por dia. O método desenvolvido e validado demonstrou ser robusto e confiável na determinação de metformina em plasma humano em detrimento dos valores de precisão e exatidão dos testes de estabilidade, ensaios inter dia encontrados. A faixa de linearidade foi de 20 a 5000 ng/mL, o que possibilitou a determinação do Cmax e Tmax da droga (fig. 2).

AGRADECIMENTOS:

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:AHMADIANI, A.; AMINI, H.; GAZERANI, P.; Determination of metformin in human plasma by high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography B; 824 (2005) 319–322.

GU, J.; WANG, Y.; TANG, Y.; FAWCETT , J., P.; BAI, X.; Rapid and sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometric method for the quantitation of metformin in human plasma;; Journal of Chromatography B; 808 (2004) 215–219.

GUINDANCE FOR INDUSTRY: Bioanalytical Methods Validation for Human Studies, 1998, p.1.

ZHANG, M.; MOORE, G., A.; LEVERC, M.; SHARON, J., G.; KIRKPATRICK C., M.J.; BEGG, E., J.; Rapid and simple high-performance liquid chromatographic assay for the determination of metformin in human plasma and breast milk; Journal of Chromatography B; 766 (2001) 175–179.