ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: DECOMPOSIÇÃO EM MINI-FRASCOS DE GÉIS DE POLIACRILAMIDA CONTENDO METALOPROTEÍNAS
AUTORES: SUSSULINI, A. - UNICAMP
GARCIA, J.S. - UNICAMP
ARRUDA, M.A.Z. - UNICAMP
RESUMO: O presente trabalho mostra a otimização de um sistema de decomposição de géis de poliacrilamida, contendo proteínas separadas por eletroforese 2D, visando a determinação de metais ligados às metaloproteínas. Este sistema permite que 24 spots de proteínas sejam decompostos simultaneamente em 52 min, além de permitir uma baixa diluição da amostra. O programa otimizado foi aplicado na decomposição de 4 proteínas de soja. As concentrações de metais obtidas foram 12000 ug g-1 de Ca na Proteína homóloga de tumor translacionalmente-controlado, 6 ug g-1 de Cu na proteína Subunidade 2 citocromo c e 80 e 288 ug g-1 de Fe nas proteínas Citocromo P450 82A4 e Fotossistema Q(B). Com base nestes resultados, o sistema de decomposição em mini-frascos mostrou ser uma ferramenta útil aos estudos metalômicos.
PALAVRAS CHAVES: decomposição assistida por microondas, mini-frascos, metaloproteínas
INTRODUÇÃO: A metalômica é uma área que está em simbiose com a genômica e a proteômica, pois a síntese e as funções metabólicas dos genes e das proteínas não ocorrem na ausência de metais (HARAGUCHI, 2004). Na metalômica, o metal presente em um sistema biológico é definido como metaloma (SZPUNAR, 2004). A identificação e a elucidação da função bioquímica ou fisiológica do metaloma em um sistema biológico são os alvos das pesquisas em metalômica. Assim sendo, a especiação química para a identificação específica de metalomas bioativos é uma das mais importantes tecnologias analíticas modernas (HARAGUCHI, 2004). A decomposição assistida por microondas de proteínas separadas por eletroforese 2D, contidas em um gel de poliacrilamida, utilizando frascos convencionais não é adequada pelo fato de que a massa das proteínas separadas na forma de spots é muito pequena e, portanto, a diluição da amostra é muito grande, o que prejudica a detecção de metais em baixas concentrações por meio de técnicas de espectrometria de absorção atômica. De modo a contornar essa limitação, a decomposição em mini-frascos é proposta neste trabalho, com o objetivo de auxiliar os estudos em metalômica.
MATERIAL E MÉTODOS: Os spots contendo as proteínas foram recortados do gel de eletroforese e secos em estufa a 40°C, até massa constante. O mesmo procedimento foi realizado para o branco analítico, que foi definido como sendo uma região do gel onde não havia spots. Cada spot seco foi pesado em um mini-frasco de polipropileno (PP) e volumes de HNO3 concentrado sub-destilado e de H2O2 30% (v/v) foram adicionados. Os mini-frascos foram mantidos abertos e deixou-se um tempo de pré-reação de 20 minutos. Após este tempo, os mini-frascos foram fechados e dispostos em um suporte de PTFE, sendo que em cada suporte tem a capacidade para 4 mini-frascos (BRANCALION et al., 2005). O suporte de PTFE foi então colocado dentro do frasco do forno de microondas, contendo 15 mL de água desionizada. A seguir, todo o conjunto foi aquecido no forno de microondas. Após a decomposição, os volumes dos mini-frascos foram ajustados a 1 mL com água desionizada e o C residual foi determinado. Um espectrômetro de absorção atômica com chama foi utilizado na determinação de Ca e um espectrômetro de absorção atômica com atomização eletrotérmica foi utilizado nas determinações de Cu e Fe.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Na otimização da decomposição foram avaliados: a quantidade de massa da amostra, a mistura dos agentes oxidantes e o programa de aquecimento. Os parâmetros otimizados foram: 1-3 mg de amostra, 200 μL de HNO3 e 150 μL de H2O2 30% (v/v) e o programa de aquecimento: 1 min@300 W, 1 min@0 W, 0,5 min@500W, 2min@0 W, 1 min@500 W, 2 min@0W, 0,5 min@800 W, 2 min@0 W, 0,5 min@800 W, 2 min@0 W, 0,5 min@800 W, 2 min@0 W, 1 min@500 W e 10 min@0 W (executado 2 vezes). Em cada rodada do programa, 24 mini-frascos foram utilizados. A %C residual determinada foi entre 0,13 e 0,68%, o que concorda com valores apresentados na literatura para este tipo de decomposição (BRANCALION et al., 2005). O gel de eletroforese 2D das proteínas de soja é mostrado na Figura 1. A seleção dos spots para a quantificação dos metais foi baseada em uma busca no banco de dados de proteínas (ExPASy PROTEOMICS SERVER, 2006). As concentrações de metais obtidas foram 80 e 288 ug g-1 de Fe nas proteínas Citocromo P450 82A4 (spot 1) e Fotossistema Q(B) (spot 2), 6 ug g-1 de Cu na proteína Subunidade 2 citocromo c (spot 3) e 12000 ug g-1 de Ca na Proteína homóloga de tumor translacionalmente-controlado (spot 4).
CONCLUSÕES: A decomposição assistida por microondas em mini-frascos de spots de proteínas contidas em géis de poliacrilamida mostrou grande potencialidade como uma ferramenta de auxílio para os estudos em metalômica, pelo fato de ser um procedimento rápido e por viabilizar a determinação de metais encontrados em baixas concentrações nas proteínas, por meio de técnicas de espectrometria de absorção atômica. A aplicabilidade do sistema proposto foi verificada pela decomposição de quatro metaloproteínas de soja, separadas previamente por eletroforese 2D, e pela determinação dos metais Ca, Cu e Fe.
AGRADECIMENTOS:Os autores agradecem à FAPESP pelas bolsas de estudo concedidas a A.S. e a J.S.G. e ao apoio financeiro concedido pela CAPES, CNPq e FAPESP.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:BRANCALION, M.L.; ARRUDA, M.A.Z. 2005. Evaluation of medicinal plant decomposition using microwave ovens and mini-vials for Cd determination by TS-FF-AAS. Microchimica Acta, 150: 283-290.
ExPASy PROTEOMICS SERVER. 2006. http://www.expasy.org, acessado em 17 de maio.
HARAGUCHI, H. 2004. Metallomics as integrated biometal science. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 19: 5-14.
SZPUNAR, J. 2004. Metallomics: a new frontier in analytical chemistry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378: 54-56.