ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE METAIS EM PROTEÍNAS DE FOLHA DE SENE (CáSSIA ANGUSTIFóLIA VAHL)
AUTORES: MAGALHÃES, C.S. - UNIFAL-MG, ARRUDA, M.A.Z. - UNICAMP
RESUMO: Este trabalho tem como o objetivo identificar as proteínas presentes na folha moída da Sene (Cássia angustifólia vahl), bem como identificar e quantificar os metais presentes nessas proteínas. Para isso, foram determinadas as concentrações totais de proteínas desta amostra pelo método de Bradford e suas proteínas foram separadas por SDS-PAGE. Foram identificadas 4 bandas protéicas, B1, B2, B3 e B4, de massas molares: 59,419, 43,378, 27,833 e 21,836 kDa, respectivamente, sendo as duas últimas as mais intensas. As bandas B3 e B4 foram decompostas por digestão ácida por microondas e foram determinadas as concentrações de Cr e Ni nas bandas B3 e B4, respectivamente, através da técnica de ETAAS e Ca na banda B4, por meio da FAAS.
PALAVRAS CHAVES: proteínas, metais, sene
INTRODUÇÃO: O proteoma tem como um dos seus objetivos fornecer informações que possam ajudar na produção de compostos menos prejudiciais às ciências da vida (SZPUNAR, 2005). Neste contexto encontra-se a Sene (Cássia angustifólia vahl) largamente usada pela fitoterapia para combater problemas do sistema digestivo, como purgativo ou acelerador do trânsito intestinal (SALLÉ, 1996). Apesar de muito utilizada, pouco se sabe sobre seu proteoma ou metaloma.
O objetivo deste trabalho é identificar as proteínas presentes na folha moída da Sene, bem como identificar e quantificar os metais presentes nessas proteínas.
MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizadas folhas de Sene (Cássia angustifólia vahl) secas e moídas (originárias da Índia), as quais foram maceradas manualmente em tampão Tris-HCl, 1mol/L, pH 6,8 com 1mmol/L PMSF. O extrato protéico foi centrifugado a 16060 g e o sobrenadante foi submetido à medida de Bradford (BRADFORD, 1976) para determinação da concentração total de proteínas. A seguir, as proteínas do extrato foram separadas por SDS-PAGE na quantidade de 0,96 ug de proteínas por slot de gel, diluídas em tampão dissociante com 5% (m/V) de 2-mercaptoetanol. As condições da corrida eletroforética foram Vi = 40 V, Ii = 50 mA e tempo de corrida aproximado de 3,5 h. Os géis foram avaliados pelo programa Gel-Pro Analyser® 3.1 da MediaCybernetics Inc. (Silver Spring, USA), sendo estimadas as massas molares das bandas protéicas, bem como as massas de proteínas de cada banda protéica (em quadruplicata). Duas bandas protéicas foram escolhidas e decompostas por digestão ácida em forno de microondas tipo cavidade (Provecto, Brasil) e foram determinadas as concentrações de Cr, Ni e Ca nas bandas protéicas por meio das técnicas ETAAS (AAnalyst 300, Norwalk, USA) e FAAS (AAnalyst 600, Norwalk, USA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Através das medidas de Bradford (BRADFORD, 1976) foi determinada a concentração de 60,2 ug/mL de proteínas totais no extrato protéico das folhas de Sene. Foi aplicado 0,96 ug de proteínas em cada slot do gel de SDS-PAGE. A Figura 1 apresenta o gel, onde foram identificadas 4 bandas, cujas massas molares são 59, 43, 28 e 22 kDa, calculadas a partir do Gel-Pro Analyser® 3.1. Foram escolhidas as bandas B3 e B4 e suas massas de proteínas estimadas: 0,475 e 0,485 ug, respectivamente. Foram determinadas as concentrações de 42,66 ug/g de Cr na B3 e 14,78 ug/g de Ni e 4,58 mg/g de Ca na B4, por absorção atômica. Pode-se ter uma estimativa da quantidade dos metais em cada proteína associando-se esses resultados com as massas de proteínas estimadas: o Cr representa 1,75% de metal na molécula de proteína B3, enquanto que, o Ni representa 0,55% e o Ca 2,5 átomos de metal para cada molécula de proteína B4. Ainda não existem dados na literatura para se compararem estes resultados, entretanto, admite-se que esses níveis correspondam à realidade, uma vez que a porcentagem de íon metálico na estrutura de uma metaloproteína deve ser bastante baixa, mesmo considerando o nível de Ca.
CONCLUSÕES: Através da SDS-PAGE foram separadas e identificadas 4 bandas protéicas das folhas de Sene, sendo que de 2 bandas eleitas foram determinadas as concentrações dos metais Cr (na banda B3) e Ni e Ca (na banda B4). Também foi possível se fazer a estimativa da porcentagem de cada átomo de metal, em relação ao número de moléculas, contribuindo, dessa forma, para avanços nos estudos metalômicos nas proteínas dessa planta.
AGRADECIMENTOS:Os autores agradecem à Fapesp, CNPq e CAPES-PQI pelo apoio financeiro e à Farmácia Musgo, Alfenas/MG, pelas amostras cedidas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:BRADFORD, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
SALLÉ, J.L., 1996. O Totum em Fitoterapia- abordagem de fitoterapia, Robe Editorial, São Paulo, p.201.
SZPUNAR, J., 2005. Advances in Analytical methodology for bioinorganic speciation analysis: metallomics, metalloproteomics and heteroatom-tagged proteomics and metabolomics. The Analyst, 130: 442-465.