ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: O FÁRMACO BROMELINA: ESTUDOS FÍSICO-QUÍMICOS E CINÉTICOS
AUTORES: SILVA, R.A.1,2; CADENA, P.G.1; LIMA FILHO, J.L.1,2; PIMENTEL, M.C.B.1,2
1LABORATóRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEISO ASAMI, LIKA – CCB- UFPE, 53.670-910, RECIFE-PE;
2 DEPARTAMENTO DE BIOQUíMICA-UFPE (ROBAFONSO@HOTMAIL.COM)
RESUMO: O presente trabalho objetivou o estudo dos aspectos físico-químicos e cinéticos da bromelina, largamente utilizado em diversas formulações farmacêuticas ou fitoterápicos. A atividade proteolítica foi medida pelo método de Leighton et al., (1972), e a concentração de proteínas pelo método de Bradford (1976). A faixa de pH estudada foi de 5,0 a 9,0, a temperatura de 25 a 90ºC. O efeito da concentração do substrato sobre a atividade proteolítica da bromelina (KM e Vmax) foi obtido usando soluções de azocaseína e azoalbumina (0,25 a 20 mg/ml). A bromelina apresentou pH e temperatura ótima de 7,2 e 60ºC. Quanto à estabilidade a bromelina foi estável até pH 8,0 e em temperaturas de 40ºC após 120 minutos. Os valores de KM e Vmax, mostraram que a bromelina teve mais afinidade pela azoalbumina.
PALAVRAS CHAVES: bromelina, protease, abacaxi
INTRODUÇÃO: Bromelina é o complexo enzimático de proteinases extraído dos vegetais da família Bromeliaceae, do qual o abacaxi é o mais conhecido e rico nesta protease. Complexo enzimático este, que tem sido usado nas preparações farmacêuticas industriais, como cápsulas digestivas, antinflamatório (WEN et al., 2006), no bloqueio à invasão dos macrófagos por Salmonela typhimurium (POSCHET et al., 1999), em pacientes com retocolite ulcerativa (KANE, 2000), queimaduras de 3º grau e na inibição de células cancerígenas (HALE, 2005). Destacam-se a bromelina do talo (E.C. 3.4.22.32), ananaina (E.C. 3.4.22.31), comosaina e a bromelina do fruto (E.C. 3.4.22.33). Entretanto, além de estudos farmacológicos, torna-se necessário um estudo das características físico-químicas e cinéticas do complexo enzimático, bromelina, na forma que é utilizado como fármaco e não de seus componentes isolados, parcialmente purificados, para entender melhor o comportamento bioquímico do complexo enzimático na forma como atua farmacologicamente. Pois os componentes do complexo podem atuar em sinergismos e/ou ressonância, melhorando suas propriedades físico-químicas e cinéticas amplificando o poder farmacológico.
MATERIAL E MÉTODOS: Atividade proteolítica da bromelina (Sigma) e concentração de proteínas foram determinadas pelo método de Leigthon et al., (1972), através da hidrólise enzimática da azocaseína ou azoalbumina a 1% (p/v) a 25ºC durante 1 h, e pelo método de Bradford (1976), utilizando uma curva de calibração com albumina bovina como padrão, respectivamente. Para estudar o efeito de pH e estabilidade da bromelina foram utilizadas soluções tampões 100 mM de: citrato de sódio (pH de 5,0 a 5,8); fosfato de sódio (pH de 6,0 a 7,0) e Tris-HCl (pH 7,2 a 9,0). Para determinação da estabilidade enzimática nos mesmos valores de pH, alíquotas foram coletadas a cada 30 minutos de reação até 120 minutos. O valor de temperatura ótima foi obtido testando a atividade proteolítica entre 25°C a 90°C e para termoestabilidade da bromelina de 30°C a 80°C, durante um período de 30 a 120 minutos. O efeito da concentração de substrato sobre a atividade da bromelina (KM e do Vmax ) foi investigado, nos parâmetros ótimos de pH e temperatura, utilizando concentração de substrato (azocaseína e azoalbumina) de 0,25 a 20 mg/mL. Os valores foram calculados nos modelos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: O pH ótimo para atividade proteolítica da bromelina foi 7,2, resultado similar (7,5) foi encontrado por Ko e Kang, (1990), Rowan et al. (1990), Suh et al. (1992). Entretanto, a bromelina, como complexo, apresentou cerca de 90% da atividade máxima nos valores de pH de 5,5 a 8,0. A bromelina foi estável até pH 8,0, retendo 68,4% e 51,14% da atividade inicial após 120 minutos, em pH 8,5 e 9,0, respectivamente. A bromelina apresentou boa atividade em todas as faixas de pH testadas, talvez isso ocorra porque é um complexo enzimático constituído por 8 frações com atividade proteolíticas diferentes (HARRACH et al., 1995). A bromelina apresentou temperatura ótima de 60ºC, mas a 50ºC, a enzima mostrou 90,1% de sua atividade máxima, sendo desnaturada acima de 60 ºC. Rowan et al. (1990) e Suh, et al. (1992), também encontraram atividade máxima a 60ºC. A bromelina foi estável até 40ºC, no decorrer de 120 minutos, e a 80ºC a enzima desnaturou-se por completo. Segundo o modelo de Lineweaver-Burk a bromelina obteve para azocaseína, KM = 8,19 mg/ml e Vmax = 193,42 U/min e para azoalbumina KM = 5,26 mg/ml e Vmax = 76,92 U/min, mostrando assim maior afinidade pela azoalbumina.
CONCLUSÕES: A bromelina apresentou pH ótimo de 7,2, e foi estável até pH 8,0, porém mostrou atividade em todos os valores de pH, confirmando ser um complexo enzimático com atividade hidrolítica. Apesar de apresentar temperatura ótima de 60ºC, a bromelina foi estável até 40 ºC, chegando a desnaturar-se em temperaturas acima de 60ºC. Os parâmetros cinéticos calculados por Lineweaver-Burk (azocaseína: KM = 8,19 mg/ml e Vmax = 193,42 U/min e azoalbumina: KM = 5,26 mg/ml e Vmax = 76,92 U/min) mostraram que a bromelina teve maior afinidade pela azoalbumina, mas com uma velocidade máxima duas vezes menor.
AGRADECIMENTOS:LIKA, PIBIC/ UFPE/CNPq, HEBRON e FINEP.
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