ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: PREDIÇÃO DOS ESTADOS OLIGOMÉRICOS VIA ZÍPERS ELETROSTÁTICOS FUSIONADOS A PROTEÍNAS FLUORESCENTES.
AUTORES: BORTOLETO-BUGS, R.K.(1); BUGS, M.R.(1); PAVANI FILHO, A.(1,2); MIRANDA, F.P.(1,3); HENRIQUE-SILVA, F.(1,4); GARCIA, J.W.(1,5)
1 PROJETO COGNITUS – CENPES/PETROBRÁS (RAQUEL@IF.SC.USP.BR); 2 CENPRA; 3 CENPES/PETROBRÁS; 4 DEPARTAMENTO DE GENéTICA E EVOLUçãO – UFSCAR; 5 NOOSFERA PROJETOS ESPECIAIS.
RESUMO: A Green Fluorescent Protein (GFP) é uma proteína com propriedades bioluminescentes. Foram desenhados para este estudo, zíperes eletrostáticos positivos e negativos associados às proteínas fluorescentes. A adição dos zíperes eletrostáticos as proteínas fluorescentes não alterou o espectro de emissão das construções quiméricas. Os resultados obtidos utilizando SAXS estão de acordo com o esperado para o zíper eletrostático - formas monoméricas para as proteínas fusionadas aos zíperes E e K e diméricas para E+K. A possibilidade de controlar a afinidade entre os zíperes e através desse artefato manipular as interações moleculares faz dos zíperes eletrostáticos ferramentas especiais com características de velcro molecular.
PALAVRAS CHAVES: proteína fluorescente, zíper eletrostático, espalhamento de raios–x a baixos Ângulos (saxs).
INTRODUÇÃO: A green fluorescent protein (GFP) foi descoberta por SHIMOMURA na medusa A. victoria (SHIMOMURA et al., 1962). Nos últimos anos, tem atraído grande interesse como marcador biológico fluorescente e na área de biotecnologia (TSIEN,1998). Mutações em diferentes aminoácidos da seqüência primária da GFP nativa permitiu o desenvolvimento de proteínas fluorescentes com cores diferentes (CHALFIE et al., 1994; CLONTECH, 2001). Para este estudo foram construídos plasmídios onde proteínas fluorescentes (GFP e a yellow fluorescent protein (YFP)) estão fusionadas a zíperes eletrostáticos carregados negativamente (ácido glutâmico) e carregados positivamente (lisina) (PHELAN et al., 2002; MARTI and BOSSHARD, 2003; PINEIRO et al., 2005). Estruturas diméricas coil-coil denominadas de zíperes são modelos simples definido pelo arranjo de sete aminoácidos que se repetem (GRUBER and LUPAS, 2003). Os zíperes E e K podem ser correlacionados ao código binário. Naturalmente, interações favoráveis são dadas por cargas opostas. Assim, a construção zíperes binários fusionados a proteínas fluorescentes permite controlar e prever os estados oligoméricos dessas construções.
MATERIAL E MÉTODOS: Amostra: Foram utilizados os plasmidios moldes pEGFP-N1 e pEYFP-Mit para a GFP e YFP (CLONTECH, 2001). Na construção a cauda de histidina está na região N-terminal da proteína e o zíper no C-terminal. A purificação foi feita utilizando a resina de níquel seguida de troca iônica. As amostras foram preparadas em 50 mM Tris-HCl, pH 8,5.
Fluorescência. Os espectros de emissão de fluorescência foram feitas no comprimento de onda de excitação de 489 e 514 nm.
SAXS e Análise dos Dados. As medidas de SAXS foram coletadas no Laboratório Nacional de Luz Sincroton (LNLS, Campinas, SP), usando o detector 1D (KELLERMANN et al., 1997). As amostras (10 e 3 mg/ml) foram medidas (22 ºC) com o comprimento de onda de 1,488 Å e a distância amostra-detector de 648 mm cobrindo um intervalo de momento de transferência q entre 0,03-0,5 Å-1 ( ). As curvas de SAXS obtidas (exposição de 10 minutos) foram corrigidas pela homogeneidade do detector e normalizadas pelo decréscimo da intensidade do feixe incidente. Os dados de SAXS foram analisados com o programa GNOM (SVERGUN, 1992) e a forma molecular ab initio das proteínas em baixa resolução foram reconstruídas usando o programa DAMMIN (SVERGUN, 1999).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A adição da cauda de histidina e dos zíperes eletrostáticos E e K, não alteraram o espectro de fluorescência da construção. Os experimentos de SAXS foram feitos para avaliar a forma oligomérica das construções fusionadas a zíperes eletrostáticos em solução. Estruturas 3D sugerem que a GFP pode ser encontrada tanto na forma monomérica (BREJC et al., 1997) quanto dimérica (YANG et al., 1996), dependendo das condições de cristalização. A figura 1 mostra os resultados obtidos dos experimentos de SAXS. Os resultados sugerem que a GFP-E e a YFP-K estão na forma monomérica. Os dados para a construção YFP- E+K sugerem uma forma dimérica. O dímero em solução foi formado pela interação eletrostática entre os zíperes. Os resultados apresentados na literatura abordam apenas as interações entre peptídeos formando zíperes eletrostáticos (MARTI and BOSSHARD, 2003; PINEIRO et al., 2005). O modelo de zíperes eletrostáticos associados a proteínas fluorescentes é uma abordagem que permite predizer a estrutura quaternária através do controle das interações entre os zíperes.
Figura 1: Curvas de SAXS das amostras: o raio de giro (Rg), a função distribuição p(r) e as formas dos modelos gerados.
CONCLUSÕES: A proteína fluorescente com zíper eletrostático possibilitou o desenvolvimento de construção com característica de velcro molecular. O velcro molecular é uma seqüência formada a partir das cargas dos aminoácidos que apresentam afinidade pré-determinada. A elaboração velcro molecular associada a proteínas fluorescentes permitirão sua aplicabilidade no desenvolvimento de construções de biossensores e de sondas biomoleculares. A construção assume uma abordagem promissora quando mutações no zíper podem ser desenhadas para gerar estruturas quaternárias como dímeros, trímeros e tetrâmeros.
AGRADECIMENTOS:R.K.B-B. agradece ao PRODOC – CAPES.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:BREJC, K.; SIXMA, T.K.; KITTS, P.A.; KAHN, S.R.; TSIEN, R.Y.; ORMÖ, M.; REMINGTON, S.J. 1997. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Protocolos National Academy Science USA, 94: 2306-2311.
CHALFIE, M.; TU, Y.; EUSKIRCHEN, G.; WARD, W.W.; PRASCHER, D.C. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263: 802-805.
CLONTECH - LIVING COLORS – User Manual Clontech Nov 2001. – www.clontech.com.
GRUBER, M.; LUPAS, N. 2003. Historical review:another 50th anniversary – new periodicites in coiled coils. Trends Biochemical Science, 28: 679-685.
KELLERMANN, G.; VICENTINI, F.; TAMURA, E.; ROCHA, M.; TOLENTINO, H.; BARBOSA, A.; CRAIEVICH, A.F.; TORRIANI, I. 1997. The small-angle X-ray scattering beamline of the Brazilian synchrotron light laboratory. J Appl Cryst, 30: 880-883.
MARTI, N.D. ; BOSSHARD, R.H. 2003. Eletrostatic interactions in leucine zippers: thermodynamics analysis of the contributions of Glu and His residues and the effect of mutating salt bridges. Journal Molecular Biology, 330: 621-637.
PINEIRO, A.; VILLA, A.; VAGHT, T.; KOKSCH, B.; MARK A. E. 2005. A Molecular dynamics study of the formation, stability, and oligomerization state of two designed coiled coils: possibilities and limitations. Biophysical Journal, 89: 3701-3713.
PHELAN, P.; GORFE, A.A.; JELESARAOV, I.; MARTI, N.D.; WARWICKER, J.; BOSSHARD, R.H. 2002. Salt bridges destabilize a leucine zipper designed for maximized ion pairing between helices. Biochemistry, 41: 2998-3008.
SHIMOMURA, O.; JOHNSON, F.H.; SAIGA, Y. 1962. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea. Journal Cellular Compendium Physiology, 59: 223-239.
SVERGUN, D.I. 1992. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J Appl Cryst, 25: 495-503.
SVERGUN, D.I. 1999. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical J., 76: 2879–2886.
TSIEN, Y.R. 1998. The green fluorescent protein. Annual Reviews Biochemistry, 67: 509-544.
YANG, F., MOSS, L.G., PHILLIPD G.N. JR. 1996. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology, 14: 1246-1251.