ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: MONITORAÇÃO DA OLIGOMERIZAÇÃO DE ZÍPERS DE LEUCINA FUSIONADOS A PROTEÍNAS FLUORESCENTES.
AUTORES: BUGS, M.R.(1); BORTOLETO-BUGS, R.K.(1); PAVANI FILHO, A.(1,2); MIRANDA, F.P.(1,3); HENRIQUE-SILVA, F.(1,4); GARCIA, J.W.(1,5)
1 PROJETO COGNITUS – CENPES/PETROBRÁS (MILTONBUGES@ITELEFONICA.COM.BR); 2 CENPRA; 3 CENPES/PETROBRÁS; 4 DEPARTAMENTO DE GENéTICA E EVOLUçãO – UFSCAR; 5 NOOSFERA PROJETOS ESPECIAIS.
RESUMO: A GFP é uma proteína com propriedades bioluminescentes isolada da A. victoria. Foram clonados para este estudo zíperes de leucina associados a proteínas fluorescentes, investigadas pelas técnicas de fluorescência e SAXS. Os resultados obtidos por SAXS sugerem que as proteínas fluorescentes estão na forma monomérica e as proteínas fluorescentes–zíper estão dimerizadas pela interação zíper–zíper. A caracterização biofísica das proteínas fluorescentes fusionadas ao zíper foi feita com a finalidade de fixar estas construções a um microambiente com placas dopadas com níquel monitorando em tempo real via proteínas fluorescentes. A tecnologia associada à fixação de proteínas fluorescentes fusionadas a zíper é a primeira etapa no planejamento e desenvolvimento de biossensores.
PALAVRAS CHAVES: proteína fluorescente, zíper de leucina, espalhamento de raios–x a baixos Ângulos (saxs).
INTRODUÇÃO: A A.victoria é uma medusa que quando estimulada produz numerosos pontos de luz devido à presença da green fluorescent protein (GFP) (SHIMOMURA et al., 1962; TSIEN, 1998). A GFP recombinante é amplamente utilizada como marcador biofluorescente (CHALFIE et al., 1994; GERDES and KAETHER, 1996). Mutações na seqüência primária da GFP permitiu o desenvovimento de proteínas fluorescentes com diferentes cores. A yellow fluorescent protein (YFP) foi desenvolvida a partir da mutação de quatro aminoácidosda na seqüência primaria da GFP (CLONTECH, 2001). Foram construídos plasmídios onde as proteínas fluorescentes estão fusionadas a zíperes de leucina. Estruturas diméricas coil-coil denominadas de zíperes são modelos simples definido pelo arranjo de sete aminoácidos que se repetem (GRUBER and LUPAS, 2003). A associação da GFP a zíperes de leucina produziu uma construção de interesse que pode ser aplicado tanto na investigação da interação proteína-proteína via zíperes complementares quanto na estabilidade e estequiometria da associação zíper-zíper e a predição da estrutura quaternária a partir do controle da interação entre essas construções (PINEIRO et al., 2005; MAGLIERY et al., 2005).
MATERIAL E MÉTODOS: Amostra: Foram utilizados os plasmidios moldes pEGFP-N1 e pEYFP-Mit para a GFP e YFP (CLONTECH, 2001). Na construção a cauda de histidina está na região N-terminal da proteína e o zíper no C-terminal. A purificação foi feita utilizando a resina de níquel seguida de troca iônica. As amostras foram preparadas em 50 mM Tris-HCl, pH 8,5.
Fluorescência. Os espectros de emissão de fluorescência foram feitas no comprimento de onda de excitação de 489 e 514 nm.
SAXS e Análise dos Dados. As medidas de SAXS foram coletadas no Laboratório Nacional de Luz Sincroton (LNLS, Campinas, SP), usando o detector 1D (KELLERMANN et al., 1997). As amostras (10 e 3 mg/ml) foram medidas (22 ºC) com o comprimento de onda de 1,488 Å e a distância amostra-detector de 648 mm cobrindo um intervalo de momento de transferência q entre 0,03-0,5 Å-1 ( ). As curvas de SAXS obtidas (exposição de 10 minutos) foram corrigidas pela homogeneidade do detector e normalizadas pelo decréscimo da intensidade do feixe incidente. Os dados de SAXS foram analisados com o programa GNOM (SVERGUN, 1992) e a forma molecular ab initio das proteínas em baixa resolução foram reconstruídas usando o programa DAMMIN (SVERGUN, 1999).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Segundo estudos, a adição da cauda de histidina ou da proteína de fusão GST (Glutathiona S Transferase) na região C-terminal da GFP não altera o espectro de fluorescência (PRASHER et al., 1992; ANGELIS et al., 1998). O espectro de fluorescência da GFP-JUN desloca para o mesmo comprimento de onda da YFP (527 nm) (CLONTECH, 2001).
A figura 1 representa os resultados dos experimentos de SAXS obtidos para as proteínas fluorescentes e as mesmas proteínas fusionadas ao zíper. Os resultados indicam que a GFP e a YFP estão na forma monomérica. Os dados dos experimentos GFP-JUN e YFP-JUN sugerem uma forma dimérica. Estruturas tridimensionais sugerem que a GFP pode ser encontrada tanto na forma monomérica (BREJC et al., 1997) quanto dimérica (YANG et al., 1996), dependendo das condições de cristalização. Uma das dúvidas decorrentes da construção, foi à possibilidade da dimerização ocorrer via superfície hidrofóbica da proteína fluorescente. Porém, conforme sugerem os resultados de SAXS, a forma dimérica foi decorrente da interação hidrofóbica entre os zíperes.
Figura 1: Curvas de SAXS das amostras: o raio de giro (Rg), a função distribuição p(r) e as formas dos modelos gerados.
CONCLUSÕES: Os resultados obtidos sugerem que na proteína fluorescente-zíper a dimerização é direcionada via contatos hidrofóbicos do zíper de leucina. Na GFP nativa a forma dimérica é estabilizada pelos contatos hidrofóbicos dos aminoácidos localizados na região C-terminal. Provavelmente, estes aminoácidos na construção proteína fluorescente-zíper estão inacessíveis espacialmente pela adição do zíper. A construção assume uma nova abordagem quando permite a imobilização via cauda de histidina num microambiente dopada com níquel, onde serão avaliadas as possibilidades do desenvolvimento de biossensores.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:ANGELIS, A.D.; MIESENBÖCK, G.; ZEMELNAN, V.B.; ROTHMAN, J. 1998. PRIM: Proximity
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