ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES CINÉTICAS DA PEROXIDASE DA FRUTA-PÃO (ARTOCARPUS INCISA)
AUTORES: SILVA, T. F. H.1 (IC)-UESB; MATOS, R. P.1 (IC)-UESB; SANTOS FILHA, M. M.(PQ)1-UESB
1DEPARTAMENTO DE QUíMICA E EXATAS - UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB (E-MAIL: MARINAFILHA@UESB.BR)
RESUMO: RESUMO: Um estudo em diferentes frutas cultivadas no Município de Jequié - BA foi realizado e a peroxidase (EC 1.11.1.7, doador: peróxido de hidrogênio óxidoredutase) do tecido da fruta-pão madura (Artocarpus incisa) foi selecionada como uma fonte alternativa para obtenção da enzima peroxidase. Após a caracterização bioquímica a atividade enzimática da peroxidase 8980 U.mL-1 foi determinada pela medida da velocidade inicial do aumento em absorbância a 470 nm, devido à formação do tetraguaiacol. As constantes cinéticas Km 7,50 x 10-2 mol.L-1 e Vmax 230,0 U.min-1 para o peróxido de hidrogênio e Km 7,50 x 10-2 mol.L-1 e Vmax 227,0 U.min-1 para o guaiacol foram obtidas, evidenciando o potencial da enzima peroxidase extraída do tecido da fruta-pão para utilização em pesquisas científicas.
PALAVRAS CHAVES: palavras chaves: artocarpus incisa, peroxidase, cinética enzimática
INTRODUÇÃO: INTRODUÇÃO: A biotecnologia constitui um novo campo de atividade em diferentes áreas de conhecimento e entre os produtos biotecnológicos desenvolvidos destacam-se as enzimas que catalisam com grande eficiência reações biológicas específicas. O uso de enzimas sintéticas é bastante difundido, porém, devido ao custo do processamento e importação dessas enzimas, é importante que se busque fontes alternativas para sua obtenção utilizando biomassa, possibilitando a sua utilização entre outros em métodos de análises químicas de baixo custo. Muitas frutas do Município de Jequié - BA ainda não foram estudadas quanto às suas características bioquímica e cinética, em específico o da atividade da peroxidase presente em tecidos da fruta-pão (Artocarpus incisa), visando o desenvolvimento de novos materiais biocatalíticos com ampla aplicação nas diferentes áreas de conhecimento. Assim, o presente trabalho teve como objetivos extrair, identificar, estabelecer a ocorrência de atividade da peroxidase do tecido da fruta-pão, efetuando a sua caracterização bioquímica e cinética, já que não existe na literatura estudo desta natureza com relação a esta fruta.
MATERIAL E MÉTODOS: MATERIAL E MÉTODOS: O extrato bruto, fonte da enzima peroxidase foi obtido de acordo com a metodologia descrita na literatura científica (CESTARI et al., 2002). Como os frutos geralmente apresentam uma série de compostos fenólicos naturais, que interferem no processo de extração da enzima e são responsáveis pela diminuição da atividade da peroxidase, foi investigada a ação dos agentes protetores e estabilizadores durante o processo de extração. A atividade da peroxidase foi determinada, a 25º C, em triplicata, por espectrofotometria a 470 nm. O método do Biureto foi utilizado na determinação da proteína total, usando albumina de soro bovino no preparo da curva padrão. No estudo cinético investigou-se o efeito do pH, a concentração da enzima, temperatura e o tempo de reação. Em seguida variou-se a concentração dos substratos peróxido de hidrogênio e guaiacol, verificando assim, o efeito da concentração da enzima sobre a velocidade da reação enzimática. Parâmetros cinéticos Km e Vmax foram obtidos através da medida da velocidade inicial a diferentes concentrações dos substratos, utilizando o método do duplo recíproco (1/Vo versus 1/[S]) proposto por Lineweaver – Burk.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: RESULTADO E DISCUSSÕES: Após a caracterização bioquímica da peroxidase pH 7,0, concentração do tampão fosfato 0,10 mol.L-1, agente protetor polyclar 10, concentração do H2O2 0,010 mol.L-1 e guaiacol 0,050 mol.L-1 foram determinadas a atividade da peroxidase 8980 U.mL-1, a proteína total 0,2920 mg.mL-1 e a atividade específica 30.753 U.mg-1 de proteína. Esses valores variam de acordo com a fonte enzimática que para a pinha foram obtidos 9533 U.mL-1, 0,2772 mg.mL-1 e 34.390 U.mg-1 (SANTOS FILHA et al., 2003). Os valores de Km e Vmax para a enzima peroxidase do tecido da fruta-pão foram: Km 7,50 x 10-2 mol.L-1 e Vmax 230,0 U.min-1 para o H2O2 e Km 7,50 x 10-2 mol.L-1 e Vmax 227,0 U.min-1, para guaiacol. Para uma concentração fixa da enzima, a seleção do melhor substrato depende da força do substrato expressa pelo baixo valor de Km e da alta eficiência catalítica expressa pelo alto valor de Vmax, conseqüentemente o critério para o melhor substrato é a razão Vmax/ Km (SOYSAL et al., 2005). O valor para Km é geralmente constante para cada substrato e enzima, enquanto Vmax varia com a concentração da enzima. O valor de Km da HRP para guaiacol foi 0,7x10-2 mol.L-1 (VIGYÁZÓ et al., 1981).
CONCLUSÕES: CONCLUSÕES: Embora os valores de Km sejam similares para o H2O2 e guaiacol, porém a eficiência catalítica (Vmax/Km) da peroxidase foi mais elevada para o H2O2. Os resultados evidenciam que a preparação enzimática da peroxidase do tecido da fruta-pão se constitui fonte potencial alternativa para obtenção da peroxidase, apresentando certas características favoráveis como: facilidade de extração, repetibilidade dos resultados e boa estabilidade em relação ao armazenamento, podendo ser usada no desenvolvimento de métodos de análises químicas de baixo custo e em outras áreas de pesquisa.
AGRADECIMENTOS:AGRADECIMENTOS: A FAPESB pela bolsa de iniciação científica concedida e aos pesquisadores do laboratório de Genética Molecular da UESB pelo uso da centrífuga.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1 - CESTARI, A. R.; VIEIRA, E. F.; NASCIMENTO, A. J. P.; SANTOS FILHA, M. M.;AIROLDI, C. 2002 Factorial design evaluation of some experimental factors for phenols oxidation using crude extracts from jackfruit (Artocarpus integrifolia). Journal Brazilian Chemical Society, 13: 260-265.
2 - SANTOS FILHA, M. M.; JESUS, S. C.; SANTOS, I. D.; LAZARO, G. S.; CARVALHO, J. 2003 Purificação e caracterização bioquímica da peroxidase em fruto da família anonácea – pinha (Anoma squamosa) In: 26a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, A química torna sua vida melhor. Poços de Caldas, Sociedade Brasileira de Química, TC044.
3 - SOYSAL, C.; SOYLEMEZ, Z. 2005 Kinetics and inactivation of carrot peroxidase by heat treatment. Journal Food Engineering 68:349-356.
4 - Vigyázó, V. L. 1981, Polyhenol oxidase and peroxidase in fruits and vegetables. CRC Critical. Reviews. Food Science. Nutrition. 49-126.