ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: INVESTIGAÇÃO QUÍMICA MACROMOLECULAR: ANÁLISE DA SUBUNIDADE RIBOSSOMAL 18S PARA CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE ASPERGILLUS FLAVUS.
AUTORES: GUEDES, R.I.C. - UFPA; SILVA, A. - UFPA; SARQUIS, M.I.M. - FIOCRUZ; SANTOS, A.S. - UFPA; SCHNEIDER, M.P.C. - UFPA
RESUMO: Este trabalho trata de dois aspectos científicos relacionados à aplicação da micotecnologia: o primeiro trata da investigação sistemática da produção de metabólitos em cultivo de fungos filamentosos. O segundo trata da identificação dos fungos filamentosos de interesse biotecnológico, por meio da taxonomia clássica e técnicas da biologia molecular, levando em consideração a análise filogenética dos microrganismos. A análise filogenética gerou cladogramas com clado composto por A. flavus 1 e 2 permanecido unido em 98% das vezes na máxima verossimilhança e 100% das vezes na parcimônia. A análise qualitativa demonstrou que espécies do A flavus , tanto a normal quanto a que sofreu pleumorfismo, produziram o mesmo metabólito, sendo identificado como 5-hidroxi, 2-hidrometil-γ-pirona.
PALAVRAS CHAVES: gênero aspergillus, biologia molecular, metabólitos de fungos.
INTRODUÇÃO: Fungos filamentosos possuem grande potencial de produção de metabólitos de interesse farmacológico e biotecnológico. Em geral, a identificação deste microrganismo é feita através da taxonomia clássica, o que em muitos casos apresenta dificuldades de seleção quando essas espécies têm reprodução assexuada, ou quando apresentam pleumorfismo. Por outro lado, alguns aspectos morfogenéticos dificultam a identificação da espécie, de modo que a identificação clássica se torna pouco adequada. Nestes casos, a utilização de ferramentas da biologia molecular como as técnicas de PCR-RFLPs, RAPD ou sequenciamento apresentam-se como um sistema alternativo de grande impacto na identificação segura destes microrganismos. Devido a mudança morfológica durante o cultivo da espécie A. flavus (Fig. 1 e 2), possivelmente devido a fatores externos ambientais, optou-se por fazer uma identificação através da biologia molecular com o seqüenciamento de um fragmento nucleotídico do gene 18S e a análise das relações filogenéticas com outras unidades taxonômicas operacionais (OTUs). Também foi comparado o metabólito secundário produzido pelo A flavus, visando a identificação quimiotaxonômica.
MATERIAL E MÉTODOS: Amostra de A. flavus e A. niger foram cultivados em 100mL de meio líquido CZAPECK, já o A. tamarii e A. terreus em 100mL de ext. de malte (todas pH 5,5), a 29°C e 120 RPM por 4 dias. O isolamento do DNA total dos fungos foi feito segundo Sambrook et al., 1998 (SANTOS, 2005). A amplificação de uma seqüência de aproximadamente 580 pb do espaçador da região 18S ribossomal foi feita via PCR com volume final de 50 µL, contendo 10mM Tris HCl pH 9,0; 50mM KCl; 0,1% Triton X-100; 0,2mg/mol BSA; 3mM MgCl2; 5pmol de cada iniciador; 0,2mM de dNTPs; 0,5U de Taq e 100ng de DNA. Reações de PCR foram feitas em termociclador programado: desnaturação 94°C por 3 min, seguida de 40 ciclos de 94°C por 1 min, 60°C por 1 min e 72°C por 1 min; e ciclo final a 72°C por 5 min. O amplicon foi purificado com auxílio do kit GFX. A clonagem feita em sistema PGem T vector, eletrotransformado em linhagem E. coli DH5 alfa e seqüenciado em sistema automático de análise de DNA MegaBace 1000. Análises filogenéticas foram feitas com auxílio do pacote PAUP. O metabólito das linhagens de A flavus, foi submetido análise qualitativa em espectrofotômetro UV-Vis a 269nm para a determinação da γ-pirona.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Análise do seqüenciamento da subunidade 18S demonstrou ser eficiente na caracterização de amostras de A. flavus que apresentaram pleumorfismo. As árvores filogenéticas geradas através do método de máxima parcimônia e agrupamento de vizinhos apresentaram estrita concordância nos arranjos envolvendo todos os OTUs, gerando cladogramas com topologias iguais. Análise de bootstrap foi realizada no banco de dados com 2000 replicas, com o clado composto por A. flavus 1 e 2 permanecido unido em 98% das vezes na máxima verossimilhança e 100% das vezes na parcimônia (Figuras 3 e 4). As seqüências foram submetidas ao GenBank para depósito e aguardam o envio da ID definitiva. Análise qualitativa espectrofotométrica realizada no metabólito produzido apenas pelas linhagens de A flavus 1 e 2 (Figura 1 e 2), demonstrou que ambas absorveram a 269nm, identificando ser a substância 5-hidroxi, 2-hidrometil-γ-pirona, caracterizando dessa forma ser o mesmo metabólito nas linhagens de A flavus analisadas.
CONCLUSÕES: Estudos químicos e genéticos apresentaram-se como ferramentas potenciais no direcionamento da identificação de microorganismos, auxiliando a taxonomia clássica. Este estudo viabiliza uma identificação segura de fungos filamentosos utilizados na busca de metabólitos secundários de interesse biotecnológico. Vale ressaltar que análise quantitativa do metabólito está sendo realizada no LabISisBio. Desta forma, este estudo quimio-genético-taxonômico assegura um procedimento de identificação correta da espécie estudada.
AGRADECIMENTOS:MCT, CNPq, CAPES, FINEP, pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:SANTOS, M.S. (2005) Análise de populações naturais de Eudocimus ruber (ciconiiformes: threskiornithidae) através de marcadores microssatélites: implicações para a conservação da espécie. Tese de Doutorado PA, UFPA. 210p.