ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: PRODUÇÃO DE LIPASE EXTRACELULAR PELO FUNGO PENICILLIUM CHRYSOGENUM UTILIZANDO COMO LEITO DE SUPORTE A FIBRA DE DENDÊ.
AUTORES: COUTINHO, R.M.P-UFPA, SILVA, SANTOS, L. S.-UFPA, SANTOS, A.-UFPA
RESUMO: Este trabalho produziu lípases a partir de uma linhagem de fungo classificada como Penicillium chrysogenum. Como técnica adequada á separação dos produtos a fibra do Rejeito de Dendê foi utilizada como um leito de suporte, que atuou como um filtro primário, para o crescimento desses fungos filamentosos. Foram realizados ensaios variando-se a concentração de esporos, entre (0,2-0,4-0,6-1-2)% para cada 100 ml de meio de cultivo de células em agitador orbitalar á 120 rpm e 29°C. Todos os meios de cultura desenvolveram-se sob a forma de “pellets”. A menor concentração (2 x 10-3 Cesp./100 ml) apresentou a melhor produção de lípase(12798 U/mL).
PALAVRAS CHAVES: este trabalho produziu lípases a partir de uma linhagem de fungo classificada como penicillium chrysogenum. como técnica adequada á separação dos produtos a fibra do rejeito de dendê foi utilizada como um leito de suporte, que atuou como um filtro primári
INTRODUÇÃO: As lípases fazem parte da ampla família das enzimas hidrolases e esterases. As lípases de bactérias, leveduras e fungos filamentosos são as mais importantes comercialmente, devido a facilidade de produção. A presença de atividade de lípase nas culturas de Penicillium chrysogenum foram detectadas principalmente quando induzidas por óleos ou ácidos graxos (FERRER, M. et al., 2000). Fungos filamentosos, principalmente os do gênero Rhizopus, Mucor, Geotrichum, Aspergillus, Fusarium e Penicillium, são amplamente usados como fontes de lípases. Um número expressivo de lípases foi purificada e caracterizada de cepas de penicillium. No entanto, os fungos de Penicillium chrysogenum são muito usados para a produção de antibióticos. Apenas alguns estudos preliminares de procedimentos para extração e purificação de lípases, com este fungo, tem sido relatado (FERRER, P. et al., 2001). Este trabalho relata a caracterização de uma lípase extracelular produzida pela linhagem fúngica de Penicillium chrysogenum. A metodologia para obtenção e purificação parcial desta enzima e a caracterização bioquímica do extrato bruto e das frações obtidas no processo de purificação foram realizadas no LabIsisBio.
MATERIAL E MÉTODOS: Nos ensaios realizados, foi empregada uma cultura pura de Penicilium chrysogenum CFAB002, proveniente do laboratório de coleção de cultura de fungos da FIOCRUZ Rio de Janeiro. Esta linhagem é conservada em tubos de ensaio, sob refrigeração,em suspensão de esporos. Nos ensaios realizados o meio de cultura líquido foi adaptado, com a seguinte composição(g/L): NaNO3(0,05%), KCl(0,05%), KH2PO4(0,2%), MgSO4.7h2O(0,05%), (NH4)2SO4(0,1%), Extrato de levedura(0,1%), Peptona(0,5%) e Azeite de oliva(2%). As culturas foram feitas em frascos de erlenmeyers de 250ml, com 100 mL de meio distribuídos. As curvas de crescimento foram iniciadas usando-se inóculos á 0,2-0,4-0,6-1-2%(v/v), nos meios líquidos a serem testados, incubados a 29°C com agitação á 120rpm durante 11 dias. A cada 24 horas, alíquotas foram retiradas assepticamente e filtradas em seringa de 1ml com filtro de algodão. Os filtrados brutos dos meios de cultura foram utilizados para as seguintes determinações: atividade lipásica, concentração de proteínas e outros. A determinação da atividade lipásica foi detectada pelo método do (pNPP) á 410 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Nos ensaios de dosagem de proteína, segundo o método de Lowry, as frações positivas se deram nos tubos:1,2,3,4,5 e 6(Tabelas 1 e 2). RATUSZNEI; SUAZO (1994) induziram o crescimento de Penicilium chrysogenum na forma de “pellets por meio da manipulação da concentração de esporos e da freqüência de agitação.A morfologia obtida nos cinco ensaios dinâmicos(Tabela3) se apresentou predominantemente na forma de “pellets” durante todo o cultivo.Os diâmetros dos “pellets” variaram(0,1 à 0,3mm). Em termos de produção de atividade lipásica, em 2% de azeite de oliva(figura 1), a produção de lípase foi surpreendente (12798 U/mL em 9 dias de cultivo)(tabela 3). A figura 2 apresenta uma comparação entre as cinéticas de produção de lípase nos dois tipos de cultivos, estático(filtro primário de fibra de dendê) e dinâmico(agitador orbitalar).A produção de lípase,em condições dinâmicas(5623,2 U/L), foi bem maior se comparada em condições estáticas(752,4 U/L). O fato relevante, em relação a esta alta produção de lípase em condições dinâmicas, se dá especialmente ao controle de agitação, que atua diretamente na dispersão de aglomerados que poderá levar à formação de “pellets” ou forma filamentosa .
CONCLUSÕES: O objetivo do trabalho foi alcançado principalmente em relação aos parâmetros de controle de obtenção de lípase, entre eles, a concentração de esporos (baixa), a freqüência de agitação(120 rpm), o azeite de oliva como agente indutor(2%). O resultado de atividade lipásica, em condições estáticas, utilizando a fibra do dendê como filtro primário, foi satisfatório, levando-se em contas sua forma de cultivo. Para elevar esta atividade faremos um novo cultivo, em maior escala, utilizando agitação controlada e os parâmetros de controle já testados com sucesso de forma dinâmica.
AGRADECIMENTOS:Capes/CNPq
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:LIMA, V. M. G. et al. Effect of Nitrogen and Carbon Sources on Lípase Production by Penicillium aurantiogriseum. Food Technol. Biotechnol. 41(2) 105-110, 2003.
RATUSZNEI, S.M.; SUAZO, C.A.T. Inducing controlled growth of Penicillium chrysogenum in pelletized form. In: GALINDO, E..; RAMIRES, O.T., ed. Advances in Bioprocess Engineering, Kluwer Academic Publishers, 1994, p.203-206.
MAHADIK, N.D. et al. Process for the preparation of acidic lipase. Tomorrow’s Technology, Today, 2003.
Ferrer, P. et al. Production of Native and Recombinant Lipases by Candida rugosa. Aplied Biochemistry and Biotechnology. Vol.95, 2001.
SAUTOUR, M., DANTIGNY, GUILHERM, M.C., BENSOUSSAN, M. Influence of inoculum preparation on the growth of Penicillium chrysogenum. Journal of Applied microbiology, 95, 1034-1038, 2003.